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　　黃素依賴型酶在自然界中廣泛分布，參與生命代謝的諸多過程，如新陳代謝、免疫防御、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等。這類酶也廣泛存在于次級代謝途徑中，參與催化形成復(fù)雜多樣的天然藥物。黃素依賴酶催化的化學(xué)反應(yīng)大多具有較強(qiáng)的區(qū)域和立體選擇性，這限制了其在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特功能或具有底物雜泛性的新型黃素依賴酶具有重要意義。 

　　近日，中國科學(xué)院昆明植物研究所黃勝雄團(tuán)隊(duì)從托酚酮吡啶生物堿rubrolones的rub基因簇異源表達(dá)菌株中分離得到了系列新的托酚酮環(huán)上三個雙鍵被還原的化合物（圖1B），晶體數(shù)據(jù)和手性液相色譜分析發(fā)現(xiàn)其中一個化合物為外消旋體。作者在生產(chǎn)托酚酮吡啶生物堿的rub和ist兩個基因簇（圖1A）中定位發(fā)現(xiàn)黃素依賴酶RubE7/IstO可能與上述化合物的形成有關(guān)。體內(nèi)外的基因敲除、互補(bǔ)和前體喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因簇中單個黃素依賴的RubE7酶能以底物1合成系列化合物，說明RubE7能還原三個不同位置的雙鍵。體外酶學(xué)功能表征發(fā)現(xiàn)RubE7/IstO既可還原托酚酮環(huán)上三個不同位置雙鍵形成，又可氧化還原產(chǎn)物6中的單鍵形成碳碳雙鍵（圖1C）。同時，作者還獲得了RubE7的同功能蛋白IstO的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該酶的催化口袋位于兩個亞基之間。通過分子對接和催化口袋大小的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)IstO蛋白的催化口袋比文獻(xiàn)報(bào)道的該類氧化還原酶大一倍（圖1C），使得底物可以在催化口袋中發(fā)生旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)，這可能是為什么單個酶能還原三個不同位置雙鍵的原因。作者還推測由于空間位阻的原因發(fā)生翻轉(zhuǎn)的概率比旋轉(zhuǎn)的低，這造成還原產(chǎn)物里只有量少的化合物4為外消旋體。最后，通過氨基酸定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)His106氨基酸是催化逆反應(yīng)（氧化形成碳碳雙鍵）)發(fā)生的關(guān)鍵殘基。 

　　研究發(fā)現(xiàn)了一種多功能的新型黃素依賴酶，可以催化非區(qū)域選擇性和非立體選擇性的還原反應(yīng)形成對映體，這在生物學(xué)上是罕見的。這種酶的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)充了天然產(chǎn)物生物合成中黃素蛋白的催化范圍，為生物催化提供了新的視角，并可激發(fā)設(shè)計(jì)多功能還原酶或氧化脫氫酶。該研究成果以“Characterization of Multifunctional and Non-stereoselective Oxidoreductase RubE7/IstO, Expanding the Functional Diversity of the Flavoenzyme Superfamily ”為題在線發(fā)表于國際著名期刊《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angew. Chem. Int. Ed.）。中國科學(xué)院昆明植物研究所顏一軍博士、余志銀博士和鐘偉碩士研究生為該論文的共同第一作者，黃勝雄研究員為通訊作者。黃勝雄研究團(tuán)隊(duì)長期聚焦于天然藥物的發(fā)現(xiàn)、生物合成和合成生物學(xué)相關(guān)研究，本工作是該團(tuán)隊(duì)在天然藥物生物合成研究上取得系列成果（Org Lett 2016、Nat Commun 2016、Nat Commun 2019、New Phytol 2020、Chem Sci 2020和ACS Catal 2021）之后的又一重要進(jìn)展。 

　　該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金（82073738、31972852和U1702285）、云南省科技廳基金（2019FJ007）和中國科學(xué)院相關(guān)項(xiàng)目（KFJ-BRP-009、2018424和QYZDB-SSW-SMC051）的資助。 

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圖1. (A)托酚酮吡啶生物堿IST和RUB的基因簇比較；(B) 部分化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(C) RubE7同功能蛋白IstO的晶體結(jié)構(gòu)及其催化的化學(xué)反應(yīng)