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　　Oxepinone環(huán)在天然產(chǎn)物的骨架結(jié)構(gòu)中頗為獨(dú)特。盡管已有研究表明GilOII加氧酶能夠產(chǎn)生含oxepinone的中間體，但隨即發(fā)生中間體開環(huán)脫羧的連續(xù)催化導(dǎo)致酶產(chǎn)物并不具有oxepinone骨架。因此，特異形成oxepinone產(chǎn)物的酶尚待發(fā)掘。高等真菌褐蓋韌革菌 (Boreostereum vibrans) 發(fā)酵液不僅富含混源萜類次生代謝產(chǎn)物韌革菌素 (vibralactone，1)，還能夠顯著積累含oxepinone骨架結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物1,5-seco-vibralactone (3)。中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾英專題組，圍繞韌革菌素的生物合成開展研究工作，2013年以來相繼揭示了韌革菌素的融合雙環(huán)內(nèi)酯骨架來源于對羥基苯甲酸 (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2298-2302; DOI: 10.1002/anie.201208182)，經(jīng)由中間體6發(fā)生芳環(huán)加氧擴(kuò)環(huán)反應(yīng)形成產(chǎn)物3的oxepinone骨架 (Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5463-5466; DOI: 10.1002 /anie.201510928)，后續(xù)由環(huán)合酶VibC催化oxepinone單元發(fā)生分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)生成韌革菌素 (Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 7209-7213; DOI: 10.1002/anie.202000710)。然而，對羥基苯甲酸 (2) 如何轉(zhuǎn)化為含oxepinone的產(chǎn)物3，包括相應(yīng)的催化酶及反應(yīng)中間體仍屬未知。 

　　在此次研究中，曾英專題組研究人員首先采用酶活性導(dǎo)向分離和蛋白質(zhì)組分析技術(shù)手段，從褐蓋韌革菌菌絲總蛋白提取物中分離鑒定了催化6加氧擴(kuò)環(huán)形成oxepinone產(chǎn)物3的黃素單加氧酶VibO，證明其黃素輔因子為FAD，且嚴(yán)格依賴NADPH；確定了VibO酶反應(yīng)副產(chǎn)物7的化學(xué)結(jié)構(gòu)，很顯然7來自6的鄰位羥化，但褐蓋韌革菌發(fā)酵液中并未檢測到7的存在。研究發(fā)現(xiàn)，隨著NADPH濃度增加，3的產(chǎn)量達(dá)到高點(diǎn)后迅速下降，而羥化產(chǎn)物7的積累則持續(xù)攀升；VibO不能將7轉(zhuǎn)化為3，更不能促使3變成7。由此可見，氧化6生成3和7的路徑不同，VibO不可能采取羥化路徑形成產(chǎn)物3的oxepinone環(huán)。通過同位素標(biāo)記和NMR分析酶產(chǎn)物，研究人員進(jìn)一步確定了加入分子氧及交換氫的位置。 

　　隨后，曾英專題組與上海有機(jī)化學(xué)研究所潘李鋒課題組開展合作，解析了VibO的晶體結(jié)構(gòu)、活性部位、以及催化機(jī)理。盡管VibO在結(jié)構(gòu)上與催化苯酚發(fā)生鄰位羥化反應(yīng)生成兒茶酚的羥化酶相近，但結(jié)構(gòu)分析及生化研究結(jié)果支持VibO采取Baeyer-Villiger氧化形成oxepinone環(huán)。光譜分析發(fā)現(xiàn)，VibO在不添加底物6時仍然消耗NADPH，反應(yīng)速度及消耗量幾乎等同于存在6的酶反應(yīng)；靜態(tài)及動態(tài)光譜特征表明黃素中間體為FAD-C4a-OO(H)。此外，研究人員還鑒定了催化對羥基苯甲酸 (2) 生成4的膜結(jié)合型異戊烯基轉(zhuǎn)移酶VibP1/VibP2，以及將中間體4分步還原為6的羧酸還原酶BvCAR和醛還原酶BvAR1/BvAR2/BvAR3。至此，研究人員徹底闡明了韌革菌素生物合成的酶分子機(jī)制，并采用一鍋法從對羥基苯甲酸成功合成3和1，同時還利用大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了韌革菌素的異源合成。 

　　該研究成果以A flavin-monooxygenase catalyzing oxepinone formation and the complete biosynthesis of vibralactone為題，在線發(fā)表于Nature Communications。曾英專題組的博士后馮克娜和博士研究生張悅，以及上海有機(jī)化學(xué)研究所博士研究生張明芳為本文共同第一作者，曾英研究員和上海有機(jī)化學(xué)研究所潘李鋒研究員為本文的共同通訊作者。這項(xiàng)工作得到國家合成生物學(xué)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。

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